产品描述
本产品为团队精心优化的间充质干细胞成软骨诱导分化试剂盒，可增强间充质干细胞向成软骨细胞分化的能力。
本产品仅用于科研用途，不可用于诊断、治疗、临床、家庭及其他用途。
产品组成成分及保存
Ø 注意：1.为保证产品的有效性，请避免反复冻融。
2. 诱导分化添加剂Ⅱ须现用现配，加入培养基后，须在12小时内用完，否则可能影响实验效果。
3. 配制好的诱导分化预混液（不含诱导分化添加剂Ⅱ）保存于2-8℃，有效期为2周。
产品使用说明（2D/3D培养）
1. 成软骨诱导分化培养基的配制
①室温条件下融化添加剂及血清。（注意：若添加剂或血清中有沉淀物，属正常现象，无须过滤，避免成分丢失。）
②配制诱导分化预混液：以下简称预混液。根据实验用量，于无菌操作台中配制。建议每次配制50mL，先加细胞基础培养基和胎牛血清，再加诱导分化添加剂。（配制比例见表一）
③配制诱导分化完全培养基：根据实验用量，按照1%的比例向预混液中添加诱导分化添加剂Ⅱ，如每1mL预混液添加10uL诱导分化添加剂Ⅱ。（注意：诱导分化添加剂Ⅱ须现用现加，配制完成的诱导分化完全培养基12h内使用完，否则将失效。）
2. 2D成软骨诱导分化实验步骤
①建议取第3~5代、纯度达90%以上、状态良好的间充质干细胞，将其消化下来，离心收集，使用含10%FBS的培养基调整细胞密度，均匀铺于培养瓶/板中。将接种好的细胞置于37℃，5%CO2，饱和湿度的培养箱中培养。（细胞接种详情参考表二）
②待细胞汇合度达80%~100%时，即可进行诱导分化。
③小心吸弃细胞培养上清，沿孔壁缓慢加入提前配制好的诱导分化完全培养基，置于37℃恒温细胞培养箱中培养。（注意：完全培养基加入细胞前需提前置于37℃预热。）
④每2day~3day换用新鲜的诱导分化完全培养基。换液时，若细胞培养上清颜色变为澄清的黄色，是由于细胞量较大，培养基消耗较快导致的，请及时调整为每日换液。（注意：完全培养基加入前需提前置于37℃预热。）
⑤细胞诱导3周后，即可进行甲苯胺蓝染色鉴定。
3. 2D成软骨细胞甲苯胺蓝染色分析
①细胞诱导分化结束后，小心吸弃细胞培养上清，1×PBS润洗1~2次，室温固定30 min。（细胞固定液为4%中性甲醛溶液等，体积参考表二）
②吸弃细胞固定液，1×PBS润洗2次。沿孔壁缓慢加入甲苯胺蓝染色液，染液体积请参考表二，室温染色30min。（注意：染色液底部可能会有沉淀，吸取时尽量不要触及底部。若染色后有沉淀，1×PBS洗去即可。）
③吸出染色液，1×PBS润洗，去掉浮色。显微镜下观察细胞染色效果，背景呈淡蓝色，成软骨细胞呈紫红色。（注意：染色液可重复使用，建议收集。）
4. 3D成软骨诱导分化实验步骤
①建议取第3~5代、纯度达90%以上、状态良好的间充质干细胞，将其消化下来，计数。调整细胞浓度，按照每管3~4×105cell将细胞转移至15mL离心管中，20℃，250×g离心4min。
②弃上清，每管加入0.5mL预混液，重悬细胞沉淀。20℃，150×g离心5min。
③弃上清，每管加入0.5mL成软骨诱导分化完全培养基重悬细胞沉淀，20℃，150×g离心5min。
④将离心管树立放置于37℃，5%CO2，饱和湿度的培养箱中培养，拧松离心管盖以便于气体交换。（注意：此步骤无需重悬细胞，且24h内不可晃动离心管。）
⑤约24h~48h后，细胞出现聚团现象，轻弹离心管底部使软骨球脱离管底悬浮于培养液中。
⑥每2~3day换用新鲜的诱导分化完全培养基，持续诱导三周后，即可将培养液更换为固定液（4%中性甲醛），将软骨球固定，后续进行切片染色鉴定实验。
质量控制
无菌检测（细菌、真菌和支原体检测）
pH测试
渗透压检测
内毒素
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注意事项
仅限科研用。
培养体系中的一些组分是对人体健康有害的物质，请不要用暴露的皮肤接触培养体系的液体和有培养体系的液体残留的容器内部；这部分有害物质的浓度和危害性都较低，如有接触，立即用自来水冲洗即可。
