本试剂盒采用Taqman探针荧光定量PCR法，设计专属探针和关键引物，特异性好，灵敏度高，其最低检测限可以达到30fg/μL水平。DNA参考品制备过程与其它宿主细胞DNA国家标准品制备一致，因此纯度高，无蛋白及离子干扰，经国家标准品浓度校正，保证了待测样品含量检测的准确度。试剂盒提供DNA稀释专用稀释液，单次实验复孔平行性及多次实验间数据重现性好。

 

二、试剂盒组成

 

* ROX参比染料为可选，是否使用取决于使用的仪器。具体可参照PART 6中的说明。

 

三、实验需要但未提供的耗材及设备

 

1.移液器：5μL-1000μL

 

2.1.5/2ml无DNA酶/RNA酶离心管

 

3.200μL无DNA酶/RNA酶PCR管

 

4.涡旋仪

 

5.迷你离心机

 

6.无DNA酶/RNA酶8联管

 

7.生物安全柜

 

8.荧光定量qPCR仪

 

四、运输和保存方法

 

1) 所有组分均干冰运输。

 

2) 试剂盒需-20℃保存，建议一年内使用完。其中组分B2需避光保存。

 

3) B2/B3/B4组分在-20℃可以保存两年，B1/B5/B6 组分在-20℃可以保存一年。此外B1/B5/B6 三个组分也可以一起另外购买。

 

五、实验前准备

 

1) 使用本试剂前请仔细阅读说明书，所有成分使用前应完全化冻，低速离心，震荡混匀。

 

2) 从-20℃冰箱取出，将组分B1(2X qPCR Mix,UDG plus)和B6（50X ROX Reference Dye）分别融解，轻轻颠倒（尽量避免产生泡沫），待溶液完全均一后再行使用。如解冻后没有使用，须彻底混匀后重新冷冻。

 

3) B2 (Primer & Probe Mix) and B4 (DNA Control)在使用前混匀时切勿反复吹打，可采用类似清洗管壁方式。注：为减少反复冻融次数和避免污染，建议初次使用时将B4 (DNA Control)分装储存于-20℃。

 

4) 已融化未使用的B3 (DNA Dilution Buffer)可保存于2-8℃ 7天，若长时间不用，请放置于-20℃。

 

5) 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作，实验开始前后紫外照射30min以消除环境中潜在的DNA污染源。

 

6) 由于荧光定量PCR实验有极强的灵敏度，保持工作环境的洁净非常重要，实验开始前建议完全清洁移液器及周边工作环境，移除清理实验过程中用不到的任何物品。

 

六、操作过程

 

（一）DNA定量参考品的稀释和标准曲线的制备

 

1）将试剂盒中的DNA Control和DNA Dilution Buffer置于冰上完全融化，轻微振荡混匀，低速离心10 sec。

 

2）取6支洁净的200ul PCR管，分别标记为S0，S1，S2，S3，S4，S5，每管各加入45μL DNA稀释液。

 

3）在标记为S0的PCR管中加入5μL DNA Control (30 ng/μL)，即3000pg/μL，快速离心10 sec，振荡5sec，再快速离心10 sec，该浓度可分装置于-20℃短期保存（不超过3个月），使用时避免反复冻融。

 

七、判定标准

 

1) 标准曲线：R²>0.99；扩增效率(Eff%)：90%≤Eff%≤110%；斜率（Slope）：-3.8~-3.1。

 

2) 加标回收率% = (加标样品测定值－样品测定值) /加标理论值*100%，范围50%-150%。