一、背景介绍
免疫球蛋白（Ig）是一组具有特殊的化学结构和免疫功能的球蛋白，存在于体液内和淋巴细胞表面，是抗体的物质基础。按结构和功能的不同分为五大类:IgG，IgM，IgA，IgD和IgE。其分子大小、电荷、氨基酸组成和碳水化合物含量很不均一。Ig分子具有结合抗原和刺激抗体生成的双重功能。IgG是血清中免疫球蛋白主成分，约占血清中免疫球蛋白总含量的75%，正常值为9.5~12.5mg/ml。其中40～50%分布于血清中，其余分布在组织中。正常人的IgG包括四个亚型，即IgG1，IgG2，IgG3，IgG4。这些亚型在补体激活的过程中结合能力各不相同。
二、实验原理
本试剂盒采用酶联免疫吸附实验双抗夹心法检测样本中人 IgG的浓度。首先将样本或者标准品加入预包被有山羊抗人抗体的微孔中，利用抗原抗体特异性结合的特点在特定条件下孵育，使样本及标准品中的IgG被捕获于聚丙烯微孔板上。然后洗板，洗去其它未结合的物质，加入偶联生物素的山羊抗人抗体，37℃条件下孵育，使包被抗体、人IgG及检测抗体形成双抗夹心复合物。洗板，再加入偶联亲和素的HRP，产生级联放大效应。最后加入显色底物溶液。显色结束后，加入硫酸溶液终止反应，颜色由蓝色变成黄色。样本或者标准品中IgG的含量与显色颜色深浅成正比，据此可以计算待检样本中人 IgG的含量。
三、试剂盒优势
(1) 覆盖度广：包被抗体及检测抗体均为种属兔来源，有较强的识别HCP能力，且该种属个体间差异小，具有高度可比性，工艺稳定。
(2) 抗体滴度高：试剂盒中使用的抗体，间接法Elisa检测抗血清效价达106。
(3) 灵敏度高：血清抗体纯化采用亲和纯化，最大限度去除非特异性抗体。
(4) 稳定性高：生产过程采用广谱蛋白稳定剂，和微孔板处理工艺，增加标准品及微孔板热稳定性和结果的可重复性。
(5) 稀释液优化：使用优化稀释液，可降低样本检测过程中非特异性吸附，本底显色极低利于观察待测样本浓度。
四、实验材料及仪器准备
1. 试剂盒内容（2-8℃冷藏）
五、实验需要但试剂盒未提供的材料
1) 10-1000μl移液器及一次性灭菌吸头
2) 多道移液器
3) 灭菌的去离子水或超纯水1L
4) 灭菌EP管
5) 吸水纸
6) 酶标仪
7) 高速离心机
8) 洗板机或者洗瓶
9) 数据分析及绘图软件
六、样本收集
收集培养的菌体，5000-7000rpm离心10分钟，弃上清，加入含溶菌酶的高渗缓冲液后经超声破碎，再次离心，上清溶液于-20℃或-80℃分装保存备用。
样本准备注意事项：
u 样本收集完毕后，要分装保存在-20°C (少于3个月) 或-80°C (少于6个月)以保持蛋白活性和避免污染。避免反复冻融，如果要在24小时内分析样本，可以保存在2- 8°C。
u 某些化学裂解液可能会对本实验造成干扰，比如SDS，Triton，谨慎使用。
u 样本液中含有沉淀物会对ELISA有干扰，务必离心去除。
u 不能加热来融化样本。
七、实验前的准备
请仔细阅读试剂盒说明书，反应在室温下进行。
八、试剂的准备
1) 试剂盒内所有试剂及包被板，请在使用前的30min拿出，使其恢复室温。
2) 洗液的稀释：将10ml 100×洗液母液，加入990ml去离子水或超纯水，混匀备用。如果浓缩液中有少许结晶，请将其置于室温，并轻轻震荡至晶体完全溶解。
3) 稀释液的准备：将10ml 10×稀释液母液，加入90ml去离子水或超纯水，混匀备用。如果浓缩液中有少许结晶，请将其置于室温，并轻轻震荡至晶体完全溶解，用作标准品，样品，检测抗体的稀释液。
九、操作步骤
1. 撕开包装袋，取出包被有抗体的酶标板，拆下不需要使用的板条，并用封口膜封好，放回铝箔袋，重新放回4℃保存（板架可重复使用）。标准品由于运输颠簸可能会粘在管壁上，使用前轻微甩匀，或在离心机上离心2秒左右。
2. 标准品的稀释：
配置标曲时提前标记8只样品稀释管，预加入一定体积的稀释液，其中IS0（98ul），S1(780ul),S2至S7(各250ul)
取标准品母液（浓度为500ug/ml）2ul加入到标记为IS0的管，震荡混匀后，接着吸取20ul浓度为10ug/ml的IS0到S1管，混匀后，取250ul浓度为250ng/ml的标准品S1到下一管,之后以2倍梯度稀释至S7（稀释过程如下图）。从稀释好后的标准曲线各浓度点分别取100ul加入空白微孔中，样本（原液或稀释液）取100ul加入空白微孔中。空白对照(Blank Control)加入100ul的样本稀释液即可。
注：标准曲线有7个点，分别命名为S1、S2、S3……S7。其中S1即标准曲线的最高浓度点（250ng/ml）。
3. 将酶标板用封板膜密封后室温振荡孵育1.5h。
4. 洗板机洗板：
Ø 取出稀释好的洗液放置于洗板机的洗瓶中备用。
Ø 取出上步中的微孔，甩去微孔中的液体，洗板机洗板5次。
Ø 洗板完成后，将微孔板倒扣在吸水纸上拍打，充分拍干至无明显水膜为止。
或手动洗板：
Ø 取出稀释好的洗液放置于洗瓶中备用。
Ø 取出上步中的微孔，甩掉微孔中的液体，在吸水纸上轻轻拍打至无明显液滴。
Ø 用多道移液枪向每个微孔中加300ul洗液，静置20s，倒去洗液，将微孔板倒扣在吸水纸上轻轻拍打。重复5次。注：第五次洗板时，充分拍干至无明显水膜为止。
5. 检测抗体：取检测抗体母液(100×)100ul到9.9ml稀释液中稀释至工作浓度(1×)，取100ul加入到各微孔中，将酶标板用封板膜密封后室温振荡孵育1.5h。
6. 洗板：重复步骤4。
7. 显色：各微孔板加入100ul TMB溶液，室温反应15min左右。若颜色浅可适当延长反应时间，勿超过30min。
8. 终止：各微孔中加入50ul终止液，终止反应。
9. 读取OD值：在波长450nm下读取OD值。
10. 数据分析：推荐使用四参数回归拟合。
十、注意事项
（一）样本收集注意事项
1、样本收集完毕后，要分装保存在-20℃（少于3个月）或-80℃（少于6个月）以保持蛋白活性，避免污染和反复冻融。如果要在24小时内分析样本，可以保存在2-8℃。
2、采集样本后如果短期内不使用，请将样本分装后冷冻保存，避免反复冻融。冷冻样本使用前请保证充分化冻，使用前用移液器或者Vortex混匀，可离心除去絮状不溶物。
3、建议所有标准品及样本都设置复孔。向微孔中加入试剂或样本后，请轻轻震荡使液体混匀，并尽量保证不要有气泡。
4、目标蛋白纯化过程通常伴随成分复杂的缓冲液，建议首次使用不同缓冲液时进行加标回收，以排除基质干扰效应。通常，高盐、低pH、多糖、有机溶剂及去污剂会导致较低回收率。
通常做法是，将稀释后的标准品S1（250ng/ml）与待测试溶液基质按照1：4体积混合（如20ul含/不含浓度为250ng/ml的标准品S1加入80ul待测溶液），计算时用加标后浓度减去加标前本底浓度，再除以理论浓度即为加标回收率。
（二）实验操作注意事项
1、请不要将本试剂盒的试剂与其他试剂盒试剂交叉使用。
2、实验操作使用一次性吸头，避免交叉污染。
3、加样：加样时要控制时间和速度，一般加样时间控制在10分钟内。如果样本数量过多，可使用多道移液器。
4、洗涤：洗涤时微孔中残留的洗涤液应在吸水纸上充分拍干，并要消除板底残留的液体和手指痕迹，避免影响最后的酶标仪读数。
5、由于底物TMB溶液是光感性的试剂，使用前请勿长时间暴露于可见光下。同时要避免TMB与金属接触。
6、反应时间的控制：加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化（比如，10分钟左右），如果颜色较深，请提前加入终止液终止反应。
7、本试剂盒中使用了稀硫酸作为终止液，其具有轻微腐蚀性，使用时应避免接触衣物或眼、手等皮肤暴露部位。
8、标准曲线的R²≥0.95。
