一、背景介绍
金黄色葡萄球菌蛋白A（SPA或者蛋白A)是一种42kDa的MSCRAMM(Microbial Surface Components Recognizing Adhesive Matrix Molecules) 表面蛋白，其最初发现于Staphylococcus aureus细胞壁中。它由五个同源的免疫球蛋白结合亚基组成，五个亚基进一步折叠形成3个螺旋束。每一个亚基可以结合来源于不同哺乳动物的蛋白，主要是IgGs。蛋白A能够以高亲和力与人IgG1，人IgG2，以及小鼠IgG2a 和IgG2b结合。蛋白A能够以中等亲和力和人IgM, IgA和IgE，及小鼠IgG3和 IgG1结合。蛋白A不会和人的IgG3和IgD结合，也不会和IgM, IgA 和IgE反应。蛋白A对抗体高亲和力使得生物医药界广泛将蛋白A用于工业生产。 生物医药上使用的用于生产抗体的蛋白A大部分都是结合到固定相层析树脂的蛋白A。亲和层析中使用的蛋白A可能会有少量从层析柱上脱落，进入到洗脱池中。这种生产过程中的蛋白A的泄漏可能会污染纯化抗体的制备。蛋白A具有与多种宿主相互作用的能力，这表明它有可能在金黄色葡萄球菌感染中是一种毒力因子。为了保证利用蛋白A亲和层析纯化的抗体的质量我们研发了Protein A ELISA试剂盒。本试剂盒在抗体浓度很高的情况下比如纯化的抗体终产品中也可以检测蛋白A的浓度。该蛋白A检测试剂盒能在确保操作简单，灵敏度高的前提下提供准确的检测结果。专门适用于治疗性蛋白及抗体纯化过程中残留的蛋白A检测。
二、实验原理
本试剂盒采用酶联免疫吸附实验双抗夹心法检测样本中蛋白A的浓度。首先将样本或者标准品加入预包被有鸡抗蛋白A抗体的微孔中，利用抗原抗体特异性结合的特点在特定条件下孵育，使样本及标准品中的蛋白A被捕获于聚丙烯微孔板上。然后洗板，洗去其它未结合的物质，加入辣根过氧化物酶标记的兔抗蛋白A抗体，37℃条件下孵育，使包被抗体、蛋白A及检测抗体形成双抗夹心复合物。洗板，加入显色底物溶液。显色结束后，加入硫酸溶液终止反应，颜色由蓝色变成黄色。样本或者标准品中蛋白A的含量与显色颜色深浅成正比，据此可以计算待检样本中蛋白A的含量。
三、试剂盒改进
(1) 特异性高：包被抗体与检测抗体分别识别同一抗原的不同特异性表位，增加了反应的特异性。同类细胞因子之间没有交叉反应。
(2) 敏感性高：检测抗体偶联生物素，与亲和素之间多价高亲和力，级联放大效应使得实验敏感度增加。
(3) 稳定性高：实验采用的是优质的包被抗体和抗原，并使用了特定的广谱蛋白稳定剂，和微孔板处理工艺，增加微孔板热稳定性和结果的可重复性。
(4) 样本稀释液优化：使用针对小鼠血清样本优化后的特异性的缓冲液，排除样本基质干扰，适用于血清，血浆等常规样本的细胞因子定量检测。
四、实验材料及仪器准备
1. 试剂盒内容（2-8℃冷藏）
五、实验需要但试剂盒未提供的材料
1) 10-1000μl移液器及一次性灭菌吸头
2) 多道移液器
3) 灭菌的去离子水或超纯水1L
4) 灭菌EP管
5) 吸水纸
6) 酶标仪
7) 高速离心机
8) 洗板机或者洗瓶
9) 数据分析及绘图软件
六、样本收集
收集培养的菌体，5000-7000rpm离心10分钟，弃上清，加入含溶菌酶的高渗缓冲液后经超声破碎，再次离心，上清溶液于-20℃或-80℃分装保存备用。
样本准备注意事项：
u 样本收集完毕后，要分装保存在-20°C (少于3个月) 或-80°C (少于6个月)以保持蛋白活性和避免污染。避免反复冻融，如果要在24小时内分析样本，可以保存在2- 8°C。
u 某些化学裂解液可能会对本实验造成干扰，比如SDS，Triton，谨慎使用。
u 样本液中含有沉淀物会对ELISA有干扰，务必离心去除。
u 不能加热来融化样本。
七、实验前的准备
请仔细阅读试剂盒说明书，反应在室温下进行。
八、试剂的准备
1) 试剂盒内所有试剂及包被板，请在使用前的30min拿出，使其恢复室温。
2) 洗液的稀释：将10ml 100×洗液母液，加入990ml去离子水或超纯水，混匀备用。如果浓缩液中有少许结晶，请将其置于室温，并轻轻震荡至晶体完全溶解。
3) 稀释液的准备：将10ml 10×稀释液母液，加入90ml去离子水或超纯水，混匀备用。如果浓缩液中有少许结晶，请将其置于室温，并轻轻震荡至晶体完全溶解，用作标准品，样品，检测抗体的稀释液。
九、操作步骤
1. 撕开包装袋，取出包被有抗体的酶标板，拆下不需要使用的板条，并用封口膜封好，放回铝箔袋，重新放回4℃保存（板架可重复使用）。标准品由于运输颠簸可能会粘在管壁上，使用前轻微甩匀，或在离心机上离心2秒左右。
2. 标准品的稀释：
配置标曲时提前标记8只样品稀释管，预加入一定体积的稀释液，其中IS0（98ul），S1(780ul),S2至S7(各250ul)
取标准品母液（浓度为500ug/ml）2ul加入到标记为IS0的管，震荡混匀后，接着吸取20ul浓度为10ug/ml的IS0到S1管，混匀后，取250ul浓度为250ng/ml的标准品S1到下一管,之后以2倍梯度稀释至S7（稀释过程如下图）。从稀释好后的标准曲线各浓度点分别取100ul加入空白微孔中，样本（原液或稀释液）取100ul加入空白微孔中。空白对照(Blank Control)加入100ul的样本稀释液即可。
注：标准曲线有7个点，分别命名为S1、S2、S3……S7。其中S1即标准曲线的最高浓度点（250ng/ml）。
3. 将酶标板用封板膜密封后室温振荡孵育1.5h。
4. 洗板机洗板：
Ø 取出稀释好的洗液放置于洗板机的洗瓶中备用。
Ø 取出上步中的微孔，甩去微孔中的液体，洗板机洗板5次。
Ø 洗板完成后，将微孔板倒扣在吸水纸上拍打，充分拍干至无明显水膜为止。
或手动洗板：
Ø 取出稀释好的洗液放置于洗瓶中备用。
Ø 取出上步中的微孔，甩掉微孔中的液体，在吸水纸上轻轻拍打至无明显液滴。
Ø 用多道移液枪向每个微孔中加300ul洗液，静置20s，倒去洗液，将微孔板倒扣在吸水纸上轻轻拍打。重复5次。注：第五次洗板时，充分拍干至无明显水膜为止。
5. 检测抗体：取检测抗体母液(100×)100ul到9.9ml稀释液中稀释至工作浓度(1×)，取100ul加入到各微孔中，将酶标板用封板膜密封后室温振荡孵育1.5h。
6. 洗板：重复步骤4。
7. 显色：各微孔板加入100ul TMB溶液，室温反应15min左右。若颜色浅可适当延长反应时间，勿超过30min。
8. 终止：各微孔中加入50ul终止液，终止反应。
9. 读取OD值：在波长450nm下读取OD值。
10. 数据分析：推荐使用四参数回归拟合。
十、注意事项
（一）样本收集注意事项
1、样本收集完毕后，要分装保存在-20℃（少于3个月）或-80℃（少于6个月）以保持蛋白活性，避免污染和反复冻融。如果要在24小时内分析样本，可以保存在2-8℃。
2、采集样本后如果短期内不使用，请将样本分装后冷冻保存，避免反复冻融。冷冻样本使用前请保证充分化冻，使用前用移液器或者Vortex混匀，可离心除去絮状不溶物。
3、建议所有标准品及样本都设置复孔。向微孔中加入试剂或样本后，请轻轻震荡使液体混匀，并尽量保证不要有气泡。
4、目标蛋白纯化过程通常伴随成分复杂的缓冲液，建议首次使用不同缓冲液时进行加标回收，以排除基质干扰效应。通常，高盐、低pH、多糖、有机溶剂及去污剂会导致较低回收率。
通常做法是，将稀释后的标准品S1（250ng/ml）与待测试溶液基质按照1：4体积混合（如20ul含/不含浓度为250ng/ml的标准品S1加入80ul待测溶液），计算时用加标后浓度减去加标前本底浓度，再除以理论浓度即为加标回收率。
（二）实验操作注意事项
1、请不要将本试剂盒的试剂与其他试剂盒试剂交叉使用。
2、实验操作使用一次性吸头，避免交叉污染。
3、加样：加样时要控制时间和速度，一般加样时间控制在10分钟内。如果样本数量过多，可使用多道移液器。
4、洗涤：洗涤时微孔中残留的洗涤液应在吸水纸上充分拍干，并要消除板底残留的液体和手指痕迹，避免影响最后的酶标仪读数。
5、由于底物TMB溶液是光感性的试剂，使用前请勿长时间暴露于可见光下。同时要避免TMB与金属接触。
6、反应时间的控制：加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化（比如，10分钟左右），如果颜色较深，请提前加入终止液终止反应。
7、本试剂盒中使用了稀硫酸作为终止液，其具有轻微腐蚀性，使用时应避免接触衣物或眼、手等皮肤暴露部位。
8、标准曲线的R²≥0.95。
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