大鼠脂肪间充质干细胞的分离培养方法及操作步骤！
小杨 / 2026-03-02 15:46:41
一、试剂与耗材
0.1% Ⅰ 型胶原酶（用 PBS 或 DMEM 配制）
完全培养基：DMEM/F12 + 10% FBS + 1% 双抗
PBS、0.25% 胰酶 - EDTA
70 μm 细胞筛网
离心管、培养瓶/皿
二、取材（无菌操作）
麻醉处死大鼠，75% 酒精浸泡消毒。
取腹股沟脂肪垫（最常用、杂质少、产量高），也可选用肾周、附睾脂肪。
PBS 冲洗 2～3 次，剔除血管、筋膜、毛发。
三、胶原酶消化
无菌眼科剪将脂肪剪至碎糜状。
加入 3～5 倍体积 0.1% Ⅰ 型胶原酶。
37℃ 水浴/摇床振荡消化 20～30 min，至呈浑浊乳状。
四、终止消化与过滤
加入等体积完全培养基终止消化，吹打混匀。
70 μm 滤网过滤，去除未消化组织块。
滤液转入离心管。
五、离心收集 SVF（血管基质组分）
250 g 离心 5 min
弃上清（上层油脂 + 液体），只留底部细胞沉淀
六、重悬接种
完全培养基重悬细胞。
接种至 T25/T75 培养瓶。
置于 37℃、5% CO₂、饱和湿度 培养。
七、纯化（关键步骤）
48 h 首次换液：
弃去未贴壁的红细胞、免疫细胞、杂质，只保留贴壁的 ADSCs。
之后每 2～3 天换液一次。
八、传代
细胞融合达 70%～80% 时传代。
PBS 洗 1 次。
加 0.25% 胰酶消化 1～1.5 min，显微镜下见细胞回缩即终止。
传代比例通常 1:2 或 1:3。
九、实验建议代数
P3～P5 代：状态最好、分化能力最强，推荐用于实验。
常见关键点（避坑）
脂肪一定要去血管、去筋膜，否则杂质多、难纯化。
胶原酶消化不要超过 40 min，否则细胞状态差。
首次换液必须48 h，太早会把刚贴壁的干细胞倒掉。
血清质量直接决定细胞长势。
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