原代星状细胞培养体系的活化控制与实验设计要点！
小杨 / 2026-02-09 11:07:08
原代肝星状细胞分离与培养体系，包含组织取材、原位灌注/两步胶原酶消化、密度梯度离心、纯化、培养、鉴定、传代与冻存完整流程，适合大鼠/小鼠原代 HSC，也可微调用于人肝组织。
一、核心原理与关键要点
星状细胞（HSC）位于肝窦周隙（Disse 间隙），富含维生素 A 脂滴，自发紫外/蓝光激发的蓝绿色自发荧光。
经典分离路线：原位门静脉灌注 → 胶原酶消化 → 密度梯度离心（Nycodenz/Percoll）富集 → 贴壁纯化。
最关键质控：纯度 >90%、活力 >85%、无明显肝细胞/枯否细胞污染。
二、试剂与耗材（标准体系）
1、无钙镁 PBS（CMF-PBS）
灌流液：含 EGTA 的平衡盐溶液（去除钙、解除细胞黏附）
消化液：胶原酶 IV + 胰蛋白酶抑制剂/ DNA 酶 I（减少碎片、防聚集）
洗涤液：含 2% FBS 的 DMEM/199
2、完全培养基（成熟体系）
基础：DMEM 高糖 或 DMEM/F12（1:1）
血清：10% FBS（胎牛血清）
双抗：100 U/mL 青霉素 + 100 μg/mL 链霉素
可选添加：胰岛素、转铁蛋白、硒（ITS，促进贴壁与存活）
三、大鼠/小鼠原代 HSC 分离（两步灌注法，最常用）
1、动物麻醉与开腹
戊巴比妥钠麻醉，固定，开腹暴露门静脉与下腔静脉（IVC）。
2、第一步灌流：去钙、松解细胞
插管门静脉，预冲无钙灌流液（含 EGTA）
流速：约 10–15 mL/min（大鼠）；微量泵/重力（小鼠）
目的：去除 Ca²⁺，断开细胞间黏附、肝窦结构松解
3、第二步灌流：胶原酶消化
换用37℃预热胶原酶 IV 消化液循环灌流
至肝脏变软、表面呈网格状、边缘略透明即停止（通常 8–12 min）
4、剪碎、过滤、终止消化
取下肝脏，剪碎于洗涤液
轻轻吹打，70 μm 细胞筛过滤
离心去肝细胞（低速轻离，取上清）
5、密度梯度离心富集 HSC
以 Nycodenz 体系为例：
配制 8–11% Nycodenz 工作液（依品系微调）
细胞悬液铺于上层
1400–1500×g，20°C，20–30 min，水平转子，无制动
取云雾状中间层（富含 HSC），PBS 洗涤 2 次
6、贴壁纯化（关键）
细胞重悬于完全培养基，接种于未包被培养瓶/皿
37℃、5% CO₂静置 1–2 h
轻柔吸走未贴壁细胞（枯否、淋巴等），换液
HSC 强贴壁，此时已高度纯化
四、培养体系与条件
1、标准培养条件
温度：37℃
气体：5% CO₂，饱和湿度
换液：首次 4–6 h 轻换液，之后每 24–48 h 换液
2、形态与自发荧光（快速鉴定）
刚分离：小而圆，胞质大量脂滴
贴壁后：不规则星状/梭形
360–380 nm 激发：蓝绿色脂滴自发荧光（HSC 特征）
五、纯度与活化鉴定（必做）
1、纯度指标
形态均一 + 自发荧光阳性率 >90%
无肝细胞（大、多边形、无脂滴）
无枯否细胞（吞噬、不规则、强黏附但无典型脂滴荧光）
2、标志物（免疫荧光/WB/qPCR）
静息 HSC：Desmin、GFAP、LRAT、视黄醇结合蛋白
活化 HSC：α-SMA、Col1a1、TIMP1、TGFβ（经典活化指标）
六、活化控制与实验设计要点
原代 HSC 在体外贴壁 24–72 h 会自发活化（类似体内纤维化）
若要维持静息表型：
低血清（2–5% FBS）
加 视黄醇/视黄酸
低氧培养（3–5% O₂）更接近体内
若要诱导活化：
10% FBS 常规培养即可自发活化
外加 TGF-β1、PDGF、脂质过氧化产物等加速
七、传代与冻存
传代：0.05% 胰酶 - EDTA 温和消化，HSC 偏脆弱，避免过度消化
冻存液：90% FBS + 10% DMSO，程序降温，液氮保存
八、常见问题与排雷
活力低、不贴壁
胶原酶温度/浓度/时间不当
灌流不畅、局部缺血
纯度差、肝细胞多
低速预离心不够
密度梯度浓度/离心参数不对
污染重（枯否/内皮）
贴壁纯化时间不足
未及时换液
活化过快
血清过高、培养时间过长、氧浓度高
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